Sequenciamento de DNA

Em tempos de pandemia, você já deve ter ouvido falar em sequenciamento de DNA. Mas você sabe o que é isso?

Descrevemos abaixo aplicações e o funcionamento deste método utilizado principalmente nas áreas de Genética e Biologia Molecular.

 

O que é DNA?

O Ácido Desoxirribonucleico (ADN em português ou DNA em inglês) é uma molécula que armazena informações sobre nossas características. Portanto ela é a responsável por transmitir as características parentais aos seu descentes.

O DNA é como um código composto por 4 letras que, em diferentes sequências, codificam nossa informação genética de forma única.

Neste código, as “letras” são as bases nitrogenadas que compõem os nucleotídeos. São elas: adenina (A), timina (T), citosina (C) e guanina (G).

Figura 1: Os nucleotídeos são compostos por um açúcar (desoxirribose), um grupo fosfato e uma base nitrogenada. Adaptado de Alberts et al (2017).

 

As bases nitrogenadas se completam entre si. A complementariedade se dá com base na formação de pares: adenina forma par com timina e citosina forma seu par com guanina (“A com T e C com G”).

Cada açúcar de um nucleotídeo se une ao próximo pelo grupo fosfato, formando cada fita do DNA.

No entanto, ele é formado por 2 fitas complementares e tem formato helicoidal (pense no fio dos telefones fixos da década de 1990).

 

Figura 2: Estrutura do DNA. As fitas de DNA são complementares entre si e formam uma estrutura helicoidal. Adaptado de ALBERTS et al., (2017).

 

As fitas de DNA têm ainda sentidos diferentes. Isso significa que nela as posições dos açúcares são inversas em cada fita. Enquanto uma está na posição chamada 5’-3’, a outra está no sentido 3’-5’.

Sendo assim, temos a molécula de DNA: duas fitas antiparalelas (sentido contrário), complementares entre si, em formato helicoidal, que armazenam a informação genética dos indivíduos.

 

O que é e para que serve o sequenciamento de DNA?

 

Agora que você já sabe o que é o DNA e qual sua função, deve imaginar o quanto é importante conhecer seu código.

O sequenciamento de DNA é um método que codifica a sequência de nucleotídeos que compõem o nosso material genético.

Este método é utilizado para identificação de micro-organismos, estudos filogenéticos e evolutivos, clonagem gênica e reprodução dentre diversas outras aplicações.

Sequenciar o DNA pode ser útil ainda para identificação e diagnóstico de doenças genéticas contribuindo com a busca por tratamentos eficientes.

Em relação à biotecnologia, quer por sua vez utiliza processos biológicos com finalidades produtivas), esta técnica ajuda a identificar micro-organismos com potencial para melhorar processos já existentes.

O sequenciamento pode ainda ajudar a desenvolver novos processos rentáveis e aplicados ao nosso dia-a-dia, como por exemplo a produção de alimentos transgênicos e a melhora de processos fermentativos.

Recentemente este método foi utilizado para identificação e estudo do novo coronavírus (SARS-CoV-2), agente causador da COVID-19.

Outra importante contribuição do sequenciamento do DNA foi o Projeto Genoma Humano, que através de sequenciamento buscou conhecer o genoma humano completo.

 

Como é feito o sequenciamento de DNA?

 

O sequenciamento baseia-se na replicação natural do DNA: a partir de uma fita simples (fita-molde), uma nova fita complementar é sintetizada.

 

 

Figura 3: Replicação do DNA. Cada nova fita é gerada a partir de uma fita-molde parental. Adaptado de ALBERTS et al., (2017).

 

Durante a síntese da fita complementar, a enzima chamada polimerase é a responsável por inserir nucleotídeos na nova fita, com base na sequência complementar à fita-molde.

A polimerase tenta inserir um novo nucleotídeo da sequência. Entretanto, só será possível inserir o nucleotídeo correto, complementar ao que está presente na fita-molde.

Vale lembrar que o DNA possui estrutura de dupla fita, em que as bases se pareiam da seguinte forma: adenina com timina (A-T) e citosina com guanina (C-G).

Sendo assim, se o nucleotídeo da fita molde for uma adenina (A), o sistema de replicação incorporará uma timina (T) na nova fita.

Quando a polimerase insere o nucleotídeo complementar na nova fita, o aparelho reconhece qual foi o nucleotídeo inserido (ATCG), e com base na complementariedade, sabe qual o nucleotídeo presente na fita-molde naquela posição.

Os pesquisadores podem identificar qual nucleotídeo foi inserido por meio de diferentes métodos. Em alguns casos, eles marcam cada nucleotídeo com material radioativo.

Em outro método, eles tratam os nucleotídeos para que, ao serem inseridos corretamente na fita de DNA, emitam fluorescência em comprimentos de onda distintos — ou seja, em cores diferentes.

Adicionalmente existem métodos em que se detecta o produto da reação de incorporação de um nucleotídeo na nova fita de DNA. Por fim, o aparelho gera então um gráfico, e sua análise permite conhecer a sequência correta de nucleotídeos no DNA .

 

Técnicas de sequenciamento de DNA

1. Sequenciamento Sanger

 Os pesquisadores ainda utilizam amplamente o método Sanger, a técnica mais antiga para sequenciar fragmentos de DNA com até 900 pares de bases (pb).

O bioquímico britânico Fred Sanger e seus colaboradores desenvolveram esse método em 1977. Embora existam técnicas mais modernas de sequenciamento, os cientistas ainda recorrem ao método Sanger para analisar fragmentos pequenos de DNA, como aqueles obtidos por clonagem ou pela reação em cadeia da polimerase (PCR).

No método Sanger, os pesquisadores utilizam os quatro nucleotídeos que compõem o DNA. No entanto, eles também adicionam à reação nucleotídeos modificados — os chamados terminadores de cadeia (dideoxinucleotídeos), que interrompem a extensão da fita durante a polimerização.

 

Figura 4. Sequenciamento de DNA Sanger. Etapas do sequenciamento de Sanger em capilar. Adaptado de ALBERTS et al., (2017).

 

Os pesquisadores modificam os dideoxinucleotídeos para impedir a adição de novos nucleotídeos durante a polimerização. Além disso, eles fazem com que esses nucleotídeos emitam cor ou radiação, permitindo sua identificação. Por isso, chamam esses compostos de “terminadores de cadeia”.

Após vários ciclos, é possível que se tenham obtidos fragmentos contendo um dideoxinucleotídeo em cada posição, e, portanto, tenham-se fragmentos de diferentes tamanhos.

Após essa etapa, os pesquisadores carreiam os fragmentos por capilares que contêm uma matriz em gel, utilizando a eletroforese capilar.

I qe mais precisa saber?

Os fragmentos menores vão se mover mais rapidamente através do gel, ao contrário dos longos que irão de forma mais lenta.

Ao final de cada capilar, um laser identifica qual o último nucleotídeo inserido na nova fita e portanto desta forma é possível identificar a sequência nucleotídica que compõe aquele fragmento.

Os pesquisadores exportam os dados obtidos na forma de um cromatograma, que mostra picos de intensidade de fluorescência. Cada cor representa um dos quatro nucleotídeos. A partir desses picos, eles determinam a sequência de DNA.

Mas por que os pesquisadores não utilizam mais esse método com tanta frequência hoje em dia?

Entretanto, apesar de ser eficiente, este método custa caro e não é o mais adequado para projetos de larga escala, como por exemplo no sequenciamento de genoma ou metagenoma.

Para atender a essa demanda, surgiram técnicas de sequenciamento de nova geração, também conhecidos como NGS (next-generation sequencing).

2. Sequenciamento de nova geração

 

As técnicas de sequenciamento de nova geração, também conhecidos como NGS (next-generation sequencing), diferenciam-se do método de Sanger por realizar muitas reações ao mesmo tempo.

Os pesquisadores realizam as reações de sequenciamento por métodos NGS em pequena escala e em paralelo, utilizando chips ou microesferas (beads).

Além da rapidez, a menor quantidade de amostra e o baixo custo são outras vantagens dos métodos NGS. Contudo, a capacidade de sequenciamento é de fragmentos de até 700 pb.

Alguns exemplos de sequenciamento NGS são:

• Pirosequenciamento com detecção de pirofosfato (454 – Roche)
• Sequenciamento por ligação (SOLiD)
• Metodologia de semicondutores (Ion)
• Sequenciamento por síntese (Illumina)
• Sequenciamento de moléculas únicas (Pacific Biosciences e o Oxford Nanopore).

Estes métodos têm aplicação para sequenciamento de genoma completo, além de metagenomas, RNA-seq, RNAs não codificantes, exomas, pequenos RNAs, amplicons, imunoprecipitados, regiões marcadas, bibliotecas enriquecidas com fragmentos-alvo, além de diversas outras aplicações.

Cada vez mais os métodos de sequenciamento de DNA estão presentes em nosso dia-a-dia, desde a pesquisa biológica básica, até áreas de estudo aplicado como biotecnologia, medicina, genética e genômica por exemplo.

Portanto, pesquisadores e profissionais aplicam essa importante ferramenta tanto na saúde pública quanto no desenvolvimento de tecnologias que melhoram nossa qualidade de vida.

Na Biovera você pode encontrar os equipamentos que fazem parte do processo de preparação da amostra para o sequenciamento como micropipetas, centrífugas para laboratório, blocos de aquecimento (Dry Block), Cabine para PCR, Termociclador, fonte de eletroforese, transiluminador.

Fontes: ALBERTS, Bruce et al. Biologia molecular da célula. Artmed Editora, 2010.