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Métodos de análise de proteínas 1

Principais métodos de análise de proteínas

O artigo Principais métodos de análise de proteínas traz alguns métodos de analise mais utilizados, tanto na área acadêmica quanto nas áreas industrial e tecnológica.

Você sabia que depois da água, o componente mais abundante do corpo humano são as proteínas? Elas são essenciais para a estrutura das células e de todo nosso corpo – desde as unhas até os cabelos.

Além disso as proteínas desempenham funções estruturais, enzimáticas, de transporte e regulação. Elas compõem anticorpos, hormônios, enzimas, fatores de coagulação, hemoglobina, dentre outras.

Sabendo disso, conhecer as proteínas e explorá-las é fundamental para melhorar a vida humana. Portanto, este estudo é importante para saúde humana e para o desenvolvimento de processos tecnológicos.

A Biovera traz abaixo alguns dos métodos de análise de proteínas mais utilizados.

  • Métodos de quantificação de proteínas

 Antes de avaliar proteínas, é importante que se quantifique e padronize as concentrações de trabalho.

A espectrofotometria é uma das técnicas para quantificação de proteínas. Ela apresenta um bom custo-benefício frente a outros métodos de quantificação. Os métodos espectrofotométricos também chamados de métodos colorimétricos ou colorimetria, quantificam a concentração de proteínas através de comprimentos de onda na região do ultravioleta ou do visível.

No entanto esta técnica avalia a capacidade de os solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos. Neste método é possível determinar a concentração de solutos, sejam eles naturalmente corados ou solutos incolores, após reação para conferir cor

Os aparelhos que podem ser utilizados para esta análise são o espectrofotômetro (em geral a leitura é realizada em cubetas) ou a leitora de microplacas ELISA cuja leitura é realizada em microplacas.

Métodos de análise de proteínas
Figura 1: A. Espectrofotômetro. B. Leitor de ELISA.

A análise quantitativa é baseada lei de Lambert-Beer. Em suma, a lei de Lambert estabelece que a intensidade de luz que atravessa o meio absorvente reduz em progressão geométrica (exponencial) em relação à intensidade de luz que incide na solução.

Adicionalmente, a lei de Beer determina que a energia deste feixe luminoso decresce de maneira exponencial à medida que a concentração do soluto presente no meio absorvente aumenta.

São exemplos de métodos de quantificação colorimétrica o método do Biureto (sensibilidade – 0,5 a 10 mg por mL), o método de Folin-Lowry (sensibilidade – 0,1 a 0,3 mg por mL), o método de BCA (sensibilidade – 0,1 a 0,5 mg por mL), e o  método de Bradford (Sensibilidade – 0,06 a 0,3 mg por mL).

  • Métodos de análise de proteínas: Purificação

 Para avaliar um grupo de proteínas ou uma proteína específica é necessário separá-la das outras. Ao obter um extrato proteico, que contem diferentes proteínas, é preciso utilizar suas características bioquímicas para separá-las.

Algumas destas propriedades envolvem seu volume molecular, carga superficial, hidrofobicidade e afinidade por ligantes. Com base nessas características, desenvolvidos métodos para purificação proteínas.

A centrifugação é o primeiro passo para separar as frações do material.No entanto como as proteínas são termosensíveis (elas desnaturam em altas temperaturas), é recomendado utilizar uma centrífuga refrigerada.

Microcentrífuga de laboratório Sigma 1-16
Figura 2: Centrífuga refrigerada.

Após a centrifugação, recolhe-se a camada rica em sua proteína de interesse. Em seguida, realiza-se o processo de diálise.

Na diálise, a porção rica em proteínas é colocada em um saco de diálise que contém poros, que será imerso em um solvente aquoso.

Neste processo, apenas as pequenas moléculas irão passar de dentro do saco de diálise para o líquido no exterior, até que se obtenha um equilíbrio da concentração de soluto no meio interno e externo.

Ao repetir este processo, renovando o solvente no exterior, obtêm-se novamente mais soluto no meio externo, em equilíbrio com a concentração do meio interno.

Em seguida, realiza-se a cromatografia. Este é um método físico-químico de separação cujo objetivo é a migração diferencial dos componentes de uma mistura, através de uma fase móvel e uma estacionária.

No entanto a  cromatografia em coluna é a mais eficiente para a separação de proteínas. Uma mistura de proteínas é aplicada em um suporte cilíndrico, preenchido por uma matriz (resina) hidratada.

A matriz é percolada com solução adequada para eluir as proteínas de interesse. Proteínas diferentes migram pela coluna com diferentes velocidades, dependendo do grau de afinidade pela matriz, permitindo sua separação.

  • Eletroforese

 A eletroforese é um método de separação de proteínas. As proteínas são aplicadas em um gel e são atraídas por carga, migrando ao longo do gel.

O gel forma uma malha e as proteínas menores migram mais rapidamente através dela. Ou seja, a velocidade de migração das moléculas é proporcional ao campo elétrico e inversamente proporcional ao seu volume molecular.

Nesse ínterim o objetivo principal desta técnica é separar moléculas orgânicas (DNA, RNA e proteínas) de acordo com sua carga elétrica e volume molecular.

Após o gel ser imerso em uma solução tampão, ao aplicar uma fonte de energia (fonte de eletroforese), tem-se então a migração e separação das proteínas carregadas, que são atraídas para o polo de carga oposta.

Ao final da corrida eletroforética, o gel é corado e apresenta bandas coloridas que se destacam em relação ao gel transparente.

  • Zimografia

 A zimografia é um método sensível capaz de avaliar a capacidade de ação de uma enzima. A diferença da composição do gel utilizado na zimografia em relação à eletroforese é a incorporação de um substrato da enzima.

Logo depois a eletroforese, o gel é incubado na temperatura ótima da ação enzimática em uma estufa. Ao final do período de incubação, o gel é corado e observa-se o fundo do gel com coloração e a formação de bandas ou halos claros onde a enzima degradou o substrato.

Estufa de Secagem MMM Ecocell - Convecção Natural
Figura 3: Estufa de incubação.
  • Western blot/Imunno blot

Esta técnica de análise de proteínas também envolve a eletroforese. A eletroforese é a primeira etapa do Western blot.

Após as proteínas serem separadas em gel, elas são transferidas para membranas de PVDF ou nitrocelulose.

O immuno blot é o western blot aonde, após a transferência para a membrana, as proteínas são identificadas com anticorpos específicos. Portanto é comum que estes termos sejam usados como sinônimos.

Esta membrana será então submetida a uma incubação com uma solução de bloqueio cuja função é recobrir as regiões da membrana que não possuem as proteínas submetidas à eletroforese, inibindo a ligação inespecífica de anticorpos.

Finalmente, a membrana é tratada com uma solução contendo o anticorpo específico para a proteína-alvo complexado a uma enzima reveladora. Ao passo que a enzima se liga à sua proteína-alvo, ela emitirá um sinal que pode ser fotossensível.

Desta forma, detecta-se a presença da proteína alvo na amostra utilizada. Ademais a  detecção pode se dar por quimioluminescência, radioatividade, colorimetria ou fluorescência.

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Referências do artigo Principais métodos de análise de proteínas:

ALBERTS, B. et al. Molecular Biology of the Cell. 6ª edição. Nova York. Garland Science, 2015.

COX, M. M.; LEHNINGER, A. L.; NELSON, D. L. Princípios de bioquímica. São Paulo, 2006.